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Universal Methylated DNA Standard

ADN Méthylé Universel Standard et Primers de Controle



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181,00 € HT

L'ADN méthylé universel standard comprend l'ADN méthylé enzymatiquement ainsi qu' un ensemble de primers spéciallement conçus pour être utilisés avec les kits EZ DNA Methylation et EZ DNA Methylation-Gold Kits .

Au départ, l'ADN de pUC19 DNA  a été isolé à partir d'une souche de bactérie (dam-, dcm-) méthylation-négative, avant de le modifier enzymatiquement avec la méthylase Sss I (EC 2.1.1.73). L'ADN est méthylé aux cytosines comprises dans les dinucléotides CG. Le set de primers à été conçu pour amplifier un fragment de l'ADN du pUC19 fourni suivi du traitement au bisulfite.

Les cytosines méthylées dans les dinucléotides CG ne sont pas converties par le traitement au bisulfite, alors que les cytosines non méthylées sont converties en uracile et détectées en thymine dans la PCR.

L'ADN méthylé de pUC19 fourni a été linéarisé en position 2177 en utilisant l'endonucléase Sca I.


I. ADN Méthylé Universel Standard, 20 µl. Contient l'ADN de pUC19 comprenant des cystosines méthylées (C5) à toutes les positions dinucléotides CG.

Concentration: 5 pg/µl d'ADN universel méthylé pUC19 et 250 ng/µl  d'ADN de sperme de saumon dans du tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH8.0).

 

II. Control Primers

Deux primers sont fournis à une concentration de 20 µM dans 20 µl d'eau.

Methyl Control Primer I (sense) contenant le site Xho I (en gras) pour le clonage.
5´-CTCTCGAGAAAATATCGTATTAGGCGTTATTCGTT-3´

Methyl Control primer II (antisense) contenant le Bam H I (en gras) pour le clonage.
5´-CGGGATCCAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTAACCG-3´

L'amplicon de PCR attendu fait 466 pb, correspondant à la séquence de nucleotide 221-670 du pUC19 plus 16pb supplémentaires pour les primers pour le clonage.



Procédures

le set de controle peut être utilisé pour les kits Zymo EZ DNA Methylation et EZ DNA Methylation-Gold Kits . Ces primers peuvente également être utilisés pour séquençage.
 
Utilisez 1 µl de la matrice controle fournie pour chaque réaction de conversion.
 
1. Préparation de la PCR
La réaction suivante est conçue pour un volume total de réaction de 25 µl.
1 µl Control Primer I
1 µl Control Primer II
1 µl de l'ADN récupéré de la réaction bisulfite
2 µl dNTP, 2.5 mM de chaque nucléotide
2.5 µl 10X tampon de réaction PCR
0.25 µl Taq polymerase
17.25 µl eau


2. Cycle de PCRe
A. 95°C, 60 secondes
B. 94.5°C, 30 secondes
C. 59°C, 30 secondes
D. 72°C, 60 secondes
E. 72°C, 7 minutes

Cycle B à D 30 fois. L'amplicon de PCR amplifié par ce jeu de primers peut être directement  utilisé pour le clonage T/A ou peut être cloné dans différents vecteurs contenant les sites Xho I et Bam H I.



 

Related PubMed Citations

Distinct Human Papillomavirus Type 16 Methylomes in Cervical Cells at Different Stages of...
Brandsma JL, Sun Y, Lizardi PM, Tuck DP, Zelterman D, Haines GK III, Martel M, Harigopal M, Schofield K, Neapolitano M | Published: 2009 Jun 20




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